Cell報道 | 西湖大學(xué)發(fā)現艱難梭菌毒素入侵人體“新大門(mén)”

科學(xué)研究有時(shí)候就像福爾摩斯破案，面對看不見(jiàn)摸不著(zhù)的對手，需要大膽假設，小心求證，外加細致入微的觀(guān)察。

“艱難梭菌”就是陶亮博士的對手之一。這是一種造成醫院和社區感染腹瀉及腸炎的重要病原體，近年來(lái)在全球各地造成了一系列爆發(fā)性感染，被美國疾病預防控制中心列為最高級別威脅的耐藥病菌。

陶亮對此跟蹤研究了9年。從2013年在哈佛醫學(xué)院做博士后至今，他一直在研究包括艱難梭菌在內的病原細菌與宿主之間的相互作用。簡(jiǎn)單說(shuō)，就是解釋艱難梭菌如何入侵人體并致病。

現在，他們有了新的重要發(fā)現。

北京時(shí)間2022年3月17日23點(diǎn)，西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陶亮團隊與施一公團隊合作，在《細胞》（Cell）在線(xiàn)發(fā)表題為“TFPI is a colonic crypt receptor for TcdB from hypervirulent clade 2?C. difficile”的最新研究成果，首次揭示了超毒力分支艱難梭菌毒素B的腸道上皮受體——TFPI蛋白。

這意味著(zhù)，他們發(fā)現了艱難梭菌毒素B入侵人體的新“大門(mén)”。

論文鏈接：https://authors.elsevier.com/a/1elpeL7PXingP（該全文下載鏈接50天內有效）

論文截圖

對手

為什么盯上艱難梭菌？

艱難梭菌是一種厭氧的革蘭氏陽(yáng)性細菌，因為分離培養比較困難，所以得名“艱難”。它普遍存在于環(huán)境中，包括空氣、水、土壤、動(dòng)物和人類(lèi)的糞便中。而人體腸道內也是一個(gè)它適合定居的場(chǎng)所。

艱難梭菌感染之所以如此嚴重，抗生素的濫用難辭其咎。當長(cháng)期使用抗生素，破壞人體正常腸道菌群時(shí)，艱難梭菌就會(huì )乘虛而入，大量繁殖，引發(fā)偽膜性腸炎、腹瀉、腸穿孔等多種疾病癥狀，嚴重時(shí)會(huì )威脅生命。

過(guò)往研究表明，艱難梭菌有5個(gè)主要的進(jìn)化分支，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型，其中II型分支由于其強致病性，又被稱(chēng)為“超毒力分支”，是近年來(lái)在北美、歐洲等地區造成數次爆發(fā)性感染的罪魁禍首。

艱難梭菌會(huì )產(chǎn)生三種毒素 ：毒素 A、毒素 B 和二元毒素。其中，毒素B（TcdB）是艱難梭菌致病的關(guān)鍵“武器”，而不同分支產(chǎn)生的毒素B，則又分屬不同的亞型（以TcdB1、TcdB2等方式標注）。

發(fā)現

它從“另一扇門(mén)”入侵人體

此前，陶亮團隊關(guān)于經(jīng)典型的艱難梭菌毒素B在腸道上皮細胞中受體的研究工作，獲得了業(yè)內廣泛的關(guān)注和認可。他們已經(jīng)發(fā)現了TcdB1、TcdB3、TcdB5重要的宿主細胞受體——FZD蛋白（注，FZD蛋白也是重要的WNT信號通路的受體）?？梢院?jiǎn)單理解為，他們已經(jīng)破解了部分TcdB是如何通過(guò) “大門(mén)”進(jìn)入腸道上皮細胞的。

但作為另一大“毒王”，“超毒力分支的艱難梭菌”專(zhuān)有表達毒素B的兩種變體（亞型）——TcdB2和TcdB4，均不識別FZD蛋白。

不知道“大門(mén)”在哪里，這兩種毒素變體又是如何進(jìn)入細胞中的？

論文圖文摘要

陶亮團隊嘗試敲除細胞中的FZD蛋白（經(jīng)典受體），細胞依然對TcdB4高度敏感。他們猜測，一定存在“另一扇門(mén)”——即某種未知受體介導了變體的毒素B入侵細胞。

利用一種名為CRISPR/Cas9的基因敲除文庫篩選技術(shù)，陶亮團隊排查出了一系列相關(guān)的候選因子，即“懷疑對象”。經(jīng)過(guò)分析后，他們鎖定了一個(gè)名為組織因子途徑抑制因子（TFPI）的蛋白，認為這個(gè)存在于細胞表面的蛋白“涉案”可能性最大，很可能就是這兩種毒素B變體進(jìn)入細胞的“另一扇門(mén)”。

求證

TFPI就是隱匿已久的新通道

為了驗證這一猜想，研究團隊思維縝密地設計并進(jìn)行了各種不同類(lèi)型的實(shí)驗。

關(guān)鍵實(shí)驗之一，敲除TFPI這扇“大門(mén)”，看TcdB4是否還能闖入細胞。

TFPI在哺乳動(dòng)物中存在α和β兩種主要的同源異構體，兩種形式都具有介導TcdB4進(jìn)入細胞的能力。由于TFPI全敲除會(huì )導致小鼠死亡，研究團隊構建了TFPIβ敲除的小鼠。隨后對小鼠進(jìn)行腹腔注射TcdB4進(jìn)行毒素挑戰實(shí)驗，發(fā)現有超過(guò)60%的純合型（TFPIβ?/?）小鼠存活了下來(lái)?！白C明TFPI是TcdB4的關(guān)鍵受體，并且顯示了腎臟是全身系統感染下的主要受損器官”，陶亮說(shuō)。

TcdB4和TFPI形成復合物的三維結構圖

關(guān)鍵實(shí)驗二，從分子水平直接“看到“毒素和受體的結合。

陶亮團隊與施一公團隊的李顏顏研究員等開(kāi)展合作，利用冷凍電鏡單顆粒三維重構技術(shù)，解析了分辨率為3.1?的毒素-受體復合物（TcdB4-TFPI）的三維結構。

隨后，通過(guò)對比， 研究團隊對艱難梭菌毒素B進(jìn)入細胞的路徑進(jìn)行了歸類(lèi)：第一類(lèi)以TcdB1/3/5為代表，從FZD這扇“大門(mén)”進(jìn)入；第二類(lèi)主要包含“超毒力分支”的TcdB2和TcdB4，選擇通過(guò)TFPI這扇“大門(mén)”進(jìn)入。

(A) 毒素-受體復合物TcdB1-FZD2與TcdB4-TFPI的結構比較。(B) 系統進(jìn)化分析發(fā)現TcdB基于受體結合區域差異可分為兩大類(lèi)，分別識別FZD和TFPI。(C) 艱難梭菌分支I、III、IV、V的TcdB識別FZD作為受體，超毒力分支II的TcdB識別TFPI作為受體。

關(guān)鍵實(shí)驗三，構建“TFPI誘餌”誘捕毒素，看能否保護細胞和實(shí)驗動(dòng)物不受傷害。

研究團隊構建了一種“TFPI誘餌”——即含有TFPI部分關(guān)鍵區域的可溶性蛋白——來(lái)迷惑并誘捕毒素分子。結果發(fā)現，無(wú)論是在細胞水平還是小鼠模型中，這類(lèi)“TFPI誘餌”都可以有效阻止超毒力分支艱難梭菌的毒素B的破壞，起到了顯著(zhù)的保護作用?！斑@不僅進(jìn)一步證實(shí)TFPI是超毒力艱難梭菌的TcdB在腸道上皮中的受體，更預示了可溶性TFPI作為中和蛋白在防治超毒力艱難梭菌感染中的潛在應用價(jià)值?！碧樟两忉屨f(shuō)。

如前文所述，艱難梭菌的特性使其在抗生素治療時(shí)效果較差且復發(fā)嚴重。而基于受體的靶向開(kāi)發(fā)，比如中和抗體，是一類(lèi)路線(xiàn)不同的新策略，理論上說(shuō)靶點(diǎn)更加精準，對人體和環(huán)境帶來(lái)的負面影響也更小。

這項研究對于揭示和理解艱難梭菌感染的致病機制、及梭菌大毒素的進(jìn)化和工作方式方面有著(zhù)重要科學(xué)意義，并且為超毒力分支菌株引起的艱難梭菌感染的預防和治療新方法的開(kāi)發(fā)提供了重要的理論依據。

西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的陶亮研究員（Lead Contact）和李顏顏研究員（施一公團隊）為本文的共同通訊作者；西湖大學(xué)博士后羅建華、博士生楊琦、博士后張曉峰、科研助理張媛媛、博士后萬(wàn)里為共同第一作者。其它合作作者包括西湖大學(xué)的研究員黃晶博士和甄瑩博士，博士后占謝超，博士研究生周瑤、賀柳晴、李丹陽(yáng)，和杭州醫學(xué)院的研究員金大智博士。此外還特別感謝波士頓兒童醫院/哈佛醫學(xué)院的董民教授和西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李黨生教授在項目進(jìn)行過(guò)程中的支持與討論。本課題受到國家自然科學(xué)基金、浙江省自然科學(xué)基金、西湖實(shí)驗室（生命科學(xué)和生物醫學(xué)浙江省實(shí)驗室）及西湖教育基金會(huì )的資助；項目實(shí)施還得到了西湖大學(xué)生物醫學(xué)實(shí)驗技術(shù)中心、實(shí)驗動(dòng)物中心和高性能計算中心的支持和幫助。

陶亮課題組簡(jiǎn)介與招聘信息

西湖大學(xué)微生物宿主交互實(shí)驗室（實(shí)驗室主頁(yè)：https://tao.lab.westlake.edu.cn/）致力于研究微生物-宿主之間的相互作用方式和內在規律，尤其是從分子、生化、細胞、生信、結構等方面研究重要病原細菌及其致病因子對宿主的影響及作用機制。西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究員陶亮近年來(lái)以第一和通訊作者在Cell、Nature、Science、Cell Research、Nature Microbiology、Nature Communications、PLOS Pathogens等學(xué)科主流期刊上發(fā)表多篇學(xué)術(shù)論文。實(shí)驗室目前有多個(gè)博士后、博士生和科研助理崗位，方向包括且不限于分子微生物學(xué)、生物信息學(xué)和微生物組學(xué)、微生物遺傳學(xué)、免疫學(xué)、結構生物學(xué)、生物化學(xué)、細胞生物學(xué)等，誠邀各方青年才俊加入、攜手共同成長(cháng)?。?lián)系方式：taoliang@westlake.edu.cn）