索氏梭菌（Paeniclostridium sordellii）是一種可以引發(fā)急性感染的革蘭氏陽(yáng)性細菌，環(huán)境分布廣泛。索氏梭菌感染不多見(jiàn)卻非常致命，可引發(fā)毒血癥，氣性壞疽，低血壓和休克等癥狀，尤其對于分娩或流產(chǎn)的女性風(fēng)險極高，急性感染發(fā)生后的致死率近100%。索氏梭菌含致死毒素（TcsL）和出血毒素（TcsH）兩種外毒素，其中致死毒素被認為是造成其高致死率的主要毒力因子。
組合重復寡肽（Combined Repetitive Oligopeptides, CROPs）是一段位于TcsL羧基端的重復序列結構。該結構目前發(fā)現僅存在于包括TcsL在內的大部分大梭菌毒素家族蛋白中，然而一直以來(lái)人們對其在毒素蛋白中的功能了解甚少。
北京時(shí)間2023年12月19日，陶亮團隊與合作者在Nature Communications上在線(xiàn)發(fā)表題為“Structural dynamics of CROPs control the stability and toxicity of Paeniclostridium sordellii lethal toxin”的研究論文（圖1），揭示了TcsL的組合重復寡肽區域具有調控毒素自剪切和毒性的功能，并從生化、細胞和結構層面闡述了其工作機制；研究還進(jìn)一步發(fā)現這種自調控機制在其它大梭菌毒素家族成員中也可能普遍存在。
文章鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41467-023-44169-z
圖1. 論文截圖
為了探究組合重復寡肽結構域的功能，研究團隊首先在枯草芽孢桿菌系統中表達了全長(cháng)和組合重復寡肽缺失的TcsL蛋白。期間團隊成員發(fā)現了一個(gè)有趣的現象：組合重復寡肽缺失的TcsL在蛋白純化過(guò)程中會(huì )自發(fā)進(jìn)行切割。通過(guò)質(zhì)譜分析和突變實(shí)驗證實(shí)切割位點(diǎn)位于543位的亮氨酸和544位的甘氨酸，這是TcsL中的半胱氨酸蛋白酶的自剪切位點(diǎn)。在全長(cháng)蛋白中，需要較高濃度的六磷酸肌醇（InsP6）才能激活半胱氨酸蛋白酶的自切割活性，這說(shuō)明缺失組合重復寡肽結構會(huì )造成TcsL中的半胱氨酸蛋白酶活性失控變得過(guò)度活躍（圖2）。
圖2. 缺失組合重復寡肽區域會(huì )造成TcsL中半胱氨酸蛋白酶活性失控
為了進(jìn)一步分析組合重復寡肽區域中抑制半胱氨酸蛋白酶活性的序列位點(diǎn)，研究者們構建了一系列毒素的截短和突變體，通過(guò)InsP6誘導的體外酶切實(shí)驗，發(fā)現不同長(cháng)度的組合重復寡肽片段對半胱氨酸蛋白酶的活性有著(zhù)不同程度的影響。更有趣的是，缺失了組合重復寡肽的TcsL在細胞上的毒性甚至高于全長(cháng)TcsL，說(shuō)明該結構區域還影響了毒素的細胞毒性（圖3）。
圖3. 不同長(cháng)度的組合重復寡肽對TcsL自剪切和細胞毒性的影響
之后，陶亮團隊與施一公團隊開(kāi)展合作，利用冷凍電鏡單顆粒三維重構技術(shù)解析了在中性條件下和酸性條件下TcsL全長(cháng)蛋白的三維結構。研究者發(fā)現，在中性條件下，TcsL呈現一種開(kāi)放式的構象；而在酸性條件下，組合重復寡肽區域會(huì )發(fā)生近180°的旋轉，形成一種關(guān)閉式的構象。其中關(guān)閉式的構象中，組合重復寡肽區域與其它結構域之間產(chǎn)生了兩個(gè)分子內的互作界面，從而牢牢地“鎖住”了毒素的其它區域（圖4）。
圖4. TcsL存在開(kāi)放和關(guān)閉這兩種不同的構象，其中關(guān)閉式構象會(huì )形成兩個(gè)分子內作用界面
接下來(lái)，研究者們模擬了TcsL釋放到環(huán)境中，之后再接觸宿主的情形。利用小鼠攻毒模型結合病理分析，研究者發(fā)現缺少組合重復寡肽區域的TcsL在存在InsP6的環(huán)境中暴露僅僅20分鐘即會(huì )完全失活，這對于一種外毒素來(lái)說(shuō)是不可接受的缺點(diǎn)。而全長(cháng)的TcsL在類(lèi)似環(huán)境下30分鐘也不會(huì )有任何活性損失（圖5）。最后，研究者們還將這一規律在大梭菌毒素家族的其他成員，包括TcdA，TcdB，TcsH和Tcnα中進(jìn)行了驗證，發(fā)現它們的組合重復寡肽區域也有著(zhù)類(lèi)似的作用。
圖5. 缺少組合重復寡肽區域的TcsL很容易在接觸宿主前就發(fā)生失活
基于上述發(fā)現，研究者們提出了一種組合重復寡肽區域調控TcsL及其它大梭菌毒素穩定性和毒性的模型（圖6）。作為一類(lèi)外毒素，TcsL在被細菌釋放到胞外后將面臨各種復雜的環(huán)境條件。毒素可能以開(kāi)放和關(guān)閉兩種構象存在，其中開(kāi)放式構象的組合重復寡肽區域舒展，暴露出毒素的核心區，這種構象對于攻擊宿主細胞更為有利。而在一些相對嚴厲的條件下（如低pH值等），毒素傾向于轉變?yōu)殛P(guān)閉式的構象，這種構象分子結構更為緊密和牢固，不易發(fā)生自剪切和降解。這種構象更利于維持毒素的穩定性和活性，直至毒素分子接觸到其目標宿主細胞。
圖6. 研究者提出的組合重復寡肽自調控毒素分子穩定性和毒性的模式圖
西湖大學(xué)微生物宿主交互實(shí)驗室（實(shí)驗室主頁(yè)：https://tao.lab.westlake.edu.cn/）致力于研究微生物-宿主之間的相互作用方式和內在規律，尤其是從分子、生化、細胞、病理、遺傳等多角度研究重要病原細菌及其致病因子對宿主的影響及作用機制。西湖大學(xué)醫學(xué)院/生命科學(xué)學(xué)院研究員陶亮近年來(lái)以通訊作者在Cell、Cell Research、Nature Microbiology、Nature Communications、PLOS Pathogens等學(xué)科主流期刊上發(fā)表多篇學(xué)術(shù)論文。實(shí)驗室長(cháng)期招收博士后、博士生和科研助理，方向包括且不限于微生物學(xué)、細胞生物學(xué)、化學(xué)生物學(xué)、分析組學(xué)、免疫學(xué)等，誠邀各方青年才俊加入、攜手共同成長(cháng)！有意者請聯(lián)系陶亮博士（taoliang@westlake.edu.cn）。
來(lái)源 / 陶亮團隊
編輯 / 陳一鳴
校對 / 朱逸青
審核 / 李凱娜
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